Enzymen
 

welkom op de homepage van Benno Beukema

Enzymen

Definitie:

Enzym (Grieks: enzym; en = in, zumè = zuurdeeg, gist; enzym = in zuurdeeg); de oude naam voor enzym  is "ferment".
( Ferment: de stof die gisting veroorzaakt =enzym; Fermentatie = gisting ).

Op een kleine groep RNA moleculen na, zijn enzymen eiwitten die werken als een biologische katalysator, dwz. versneller van (bio)chemische processen die zich in levende organismen afspelen.
( RNA: ribonucleic acid - ribonucleïnezuur ).


Een groot deel van de kleine groep RNA moleculen ( ribozymen of RNA enzymen) katalyseren of de eigen splitsing of de splitsing van andere RNA's, maar ze kunnen ook de aminotransferase-activiteit van ribosomen activeren.
Wetenschappers hebben in het laboratorium zelfs ribozymen kunnen produceren die onder specifieke condities in staat zijn de eigen synthese te katalyseren.

Enkele bekende ribozymen zijn: ribonuclease;  groep I en groep II introns;  hammerhead, hairpin and hepatitis delta virus (HDV) ribozymes ( Human Molecular Genetics ).
 

Historie:

• Ongeveer 10.000 voor Christus: Fermentatie; het proces dat tot de ontdekking van enzymen leidde.
   
• 2000 voor Christus: Egyptenaren en Sumerianen ontwikkelen fermentatie voor gebruik in brouwen, brood bakken en het maken van kaas.
   
• 800 voor Christus: de magen van kalveren en het enzym chymosine werden gebruikt om kaas te maken.
   
• Middeleeuwen: alchemisten identificeren alcohol als product van fermentatie.
   
• Alcoholische fermentatie is ontegenzeggelijk de oudste bekendste enzym reactie. Deze en andere fenomenen werden tot 1857 gedacht spontane reacties te zijn. In 1857 concludeerde de Franse chemicus Louis Pasteur dat alcoholische fermentatie  wordt gekatalyseerd door "fermenten" en alleen plaatsvindt in de aanwezigheid van levende cellen. Vervolgens echter, ontdekte de Duitse chemicus Eduard Buchner in 1897 dat een celvrij extract van gist alcoholische fermentatie kan veroorzaken. De oude puzzel was nu opgelost....; de gistcellen produceren het enzym en het enzym laat de fermentatie verlopen.

Anselme Payen

• De Zweedse chemicus Jons Jakob Berzelius (1779–1848) verrichtte reeds in 1835 een van de eerste onderzoeken en noemde de chemische actie van enzymen katalytisch.

  Berzelius: The concept of catalysis:

  "The catalytic force is reflected in the capacity that some substances have, by their mere presence and not by their own reactivity, to promote changes in otherwise stable and unreactive molecules...
  ... in living plants and animals, thousands of catalytic  processes occur within the tissues and fluids,
  generating a multitude of substances of differing chemical compositions..."

Jons Jakob Berzelius

(1779–1848)

• Bij zijn onderzoek naar verteringsprocessen isoleerde Theodor Schwann in 1836 een substantie die verantwoordelijk was voor de eiwithoudende vertering in de maag en noemde deze substantie pepsine.
  Pepsine ( Grieks: pepsis = verteren).
  EC 3.4.23.1  officiële naam: Pepsin A
  Alternatieve naam: Pepsin.

Theodor Schwann ( 1810 - 1882 )

• De Duitse fysioloog Wilhelm Friedrich Kühne (1837-1900) vond in 1867 een substantie in pancreassap die andere biologische substanties afbrak.
  Deze substantie noemde hij "Trypsine". ( Eng: trypsin EC 3.4.21.4)
  Kühne stelde voor de biokatalysatoren "enzymen" te noemen. ( De naam "ferment" en "enzym" zijn aan gist gerelateerd).
   

Wilhelm Friedrich Kühne
 

• In 1874 vervaardigde Hansen chymosine uit de magen van kalveren voor de productie van kaas.
  
   
• In 1883 ontwikkelde Johan Kjeldahl een analytische methode om stikstof te detecteren in bepaalde organische stoffen. Deze methode was de basis voor de ontwikkeling van de kwantitatieve enzymologie en algemene biotechnologie.

Johan Kjeldahl ( 1849 - 1900  )

 

• In dit zelfde jaar (1883) ontdekte en ontwikkelde Emil Christian Hansen  een methode om gist te vermeerderen, waarna het mogelijk werd gist te produceren voor industrieel gebruik.
   

Emil Christian Hansen ( 8 mei 1842 - 27 augustus 1909 )

 

• Emil Hermann Fischer, die zijn onderzoek in suikers in 1883 begon, stelde de moleculaire structuur van fructose, glucose en vele andere suikers vast. Tijdens zijn stereochemisch onderzoek stelde hij vast dat er twee soorten suiker zijn: _D-suikers en _L-suikers. ( _D = dextro =rechts en  _L= Levo = links). 

  

  Hij onderzocht de reacties en de substanties die betrokken zijn bij de fermentatie en legde tijdens zijn onderzoeken hoe enzymen suikers afbreken de grondslag voor de enzymchemie.
  De specifieke actie van een enzym met een enkel substraat kan worden uitgelegd volgens de "slot en sleutel" theorie. Dit "slot en sleutel" verhaal werd voor het eerst gepostuleerd door Fischer in 1895.
  In dit verhaal is een enzym een slot en het substraat een sleutel. Alleen de juiste sleutel (substraat) past in het juiste slot (enzym).
  
  ( "... the intimate contact between the molecules ... is possible only with similar geometrical configurations. To use a picture, I would say that the enzyme and the substrate must fit together like a lock and key."

  Emil Fischer, 1895 )

  

  Emil Hermann Fischer (1852-1919)

• Later bleek dat het slot en sleutel verhaal niet geheel correct is. Het is nu bekend dat de actieve zijde  van enzymen vormen hebben die corresponderen met vormen van het substraat nadat het substraat gebonden is. Men heeft een aangepaste theorie voorgesteld: "The induced fit"  theorie. Deze theorie neemt aan dat het substraat een rol speelt bij de uiteindelijke vorm van het enzym en dat het enzym gedeeltelijk flexibel is en werd in 1958 beschreven door Daniel E. Koshland Jr

Daniel E. Koshland Jr.  30 maart 1920 - 23 juli 2007

 

• Wilhelm Ostwald definieerde in 1893 katalysatoren en enzymen en bevestigde de katalytische theorieën van Jons Jakob Berzelius.

Wilhelm Ostwald (1853 - 1932 )

 

• Jokichi Takamine was de eerste persoon die een enzym uit een microbische bron vervaardigde.  Hij vervaardigde taka-diastase uit Aspergillus ( schimmelgeslacht) als een verteringsenzym in 1894.
  
   

Dr. Jokichi Takamine: Japanese Father of American Biotechnology
 

• In 1926 werd het eerste enzym in pure vorm verkregen. Dit feit werd volbracht door James B. Sumner van de Cornell University. Sumner was in staat om het enzym urease uit een vrucht van de broodvruchtboom te isoleren en te kristalliseren. Hiervoor kreeg hij in 1946 de Nobelprijs.
  Sumner suggereerde, in tegenstelling tot de heersende opvattingen, dat enzymen eiwitten zijn. De meeste critici in die tijd geloofden dat pure enzymen geen eiwitten bevatten.
   
• John H. Northrop en Wendell M. Stanley van de Rockefeller Institute for Medical Research deelden de Nobelprijs met Sumner. Zij ontdekten een complexe procedure om pepsine te isoleren.
  Deze precipitatie techniek die bedacht is door  Northrop and Stanley werd gebruikt om verschillende enzymen te kristalliseren.
  Behalve pepsine, kristalliseerde Northrop ook trypsine en chymotrypsine; daarbij aantonend dat deze enzymen eiwitten zijn.
  
   

  James B. Sumner	John H. Northrop	Wendell M. Stanley

  
  
  ( Pepsine, een mengsel van eiwitsplitsende enzymen. Het wordt in de maag gevormd uit het eiwit pepsinogeen. Het breekt eiwitten af tot vrij grote peptidebrokstukken waarvan verdere afbraak plaatsvindt in de dunne darm)
  
  Pepsin A: EC 3.4.23.1 ; Pepsin B: EC 3.4.23.2 ; Pepsin C: EC 3.4.23.3
  
  Chymotrypsin:  EC 3.4.21.1;  Chymotrypsin C:  EC 3.4.21.2
  
  Link: The Nobel Prize in Chemistry 1946

  
   

Enzymen:

Enzymen zijn producten van de levende cel.
Het unieke van een levende cel is, dat deze in staat is een grote verscheidenheid aan reacties met grote efficiëntie en specificiteit ondanks de milde fysiologische omstandigheden (lage temperatuur neutrale pH) te laten verlopen.

De belangrijkste stoffen die zorg dragen voor de processen in de cel zijn de enzymen. De verbindingen die door de enzymen worden omgezet noemt men substraten.

Enzymen zijn eiwitten die door het lichaam zelf worden aangemaakt uit deeltjes van eiwit afkomstig uit de voeding. Meestal is een enzym een zogenaamd samengesteld eiwit, dat wil zeggen een eiwit chemisch verbonden met een niet-eiwit, dat als coënzym of als activator kan optreden.

Een enzym is een splitsings - of ontledingsstof, die een bepaald scheikundig proces in het organisme veroorzaakt of bevordert, zonder zelf te veranderen. Enzymen zijn biochemische katalysatoren zonder welke een stofwisseling en spijsvertering onmogelijk zouden zijn.

Enzymen zijn zeer specifiek. Dat wil zeggen dat voor ieder substraat een apart enzym nodig is. Voor de werking zijn enzymen o.a. afhankelijk van de temperatuur en de zuurgraad. De meeste enzymen katalyseren processen met een snelheid van 1 tot 10.000 omzettingen per seconde per enzymmolecuul.

De snelheid van de enzymatische reactie neemt toe naarmate de hoeveelheid actief enzym groter is. Door een nauwgezette regulatie van de actieve hoeveelheid van elk enzym is de levende cel in staat het verloop van elke reactie te reguleren en hierdoor wordt een strakke coördinatie van alle chemische reacties mogelijk.

Aangezien vrijwel alle biologische processen (synthese, groei, uitscheiding e.d.) door enzymen gekatalyseerd worden, worden de fysiologische eigenschappen of het karakter van een levend organisme (van een levende cel) bepaald door de enzymen die erin aanwezig zijn. Dat een levercel zich blijft gedragen als een levercel en nooit als een niercel (hoewel beide zijn ontstaan uit één enkele eicel) vloeit dus voort uit het feit dat een levercel een bepaalde verzameling enzymen bezit en een niercel een andere verzameling enzymen. Dat een bepaalde cel bepaalde enzymen wel en andere niet bezit, komt doordat die cel alleen die bepaalde enzymen kan produceren.

Enzymen en coënzymen hebben slechts een beperkte levensduur en ze moeten op tijd vervangen worden. Daarom moeten er in het dieet voldoende aminozuren, vitaminen en metaalionen aanwezig zijn om de afgebroken enzymen en coënzymen tijdig te kunnen vervangen.

Vitaminen zijn organische moleculen die onmisbaar zijn voor de opbouw van enzymen en coënzymen die niet door het organisme zelf gemaakt kunnen worden. Daardoor is het noodzakelijk dat ze via het voedsel worden opgenomen.

De mens heeft eveneens slechts een beperkte mogelijkheid om essentiële metaalionen op te slaan, en de biologische labiliteit van de meeste metallo-enzymen vereist dat ook deze ionen dagelijks via ons voedsel worden opgenomen.

 

Werking:

Voor de werking van de enzymen is het interne milieu van de levende cel niet vereist. Ze kunnen dus na verbreking van de celstructuur worden geïsoleerd en gezuiverd en in de reageerbuis (in vitro) worden bestudeerd. Hieruit blijkt dat de katalytische eigenschappen van de enzymen verankerd zijn in hun structuur.

Het is gebleken dat het overgrote deel van de enzymen behoort tot de eiwitten. Dankzij de sterk toegenomen kennis van de eiwitstructuur is het mogelijk geworden de uitzonderlijke eigenschappen van de enzymen te verklaren en te voorspellen. Een eiwit blijkt te zijn opgebouwd uit een groot aantal verschillende bouwstenen (aminozuren), die in een vaste, specifieke volgorde aaneengeregen zijn. De specifieke volgorde van de aminozuren in de eiwitketen is bepalend voor de wijze waarop de ketens bij gegeven pH e.d. ruimtelijk worden opgevouwen. Uitsluitend aan de aldus voorgeschreven ruimtelijke structuur danken de enzymen hun specifieke eigenschappen. Verlies van deze ruimtelijke structuur (denaturatie) leidt dan ook tot activiteitsverlies.

Een enzym gaat met de om te zetten verbinding (het substraat) een complex aan, dat na afloop van de reactie weer uiteenvalt in product en onveranderd enzym. De binding van het substraat vindt plaats aan één bepaalde plek op het ruimtelijk eiwitbouwsel, het actieve centrum. De rangschikking van de aminozuren in en rondom dit actieve centrum is verantwoordelijk voor het katalytisch effect en de goede rangschikking van de bij de activiteit betrokken aminozuren is alleen bij de ene, unieke ruimtelijke eiwitstructuur gerealiseerd.

De ruimtelijke opvouwing van een eiwitketen is onder meer afhankelijk van de pH (zuurgraad) en dit verklaart de sterke pH-afhankelijkheid van de enzymatische activiteit. De meeste enzymen zijn slechts in een zeer beperkt pH-gebied optimaal actief (het optimum ligt doorgaans bij pH 5–8). Buiten dit pH-gebied verliezen de enzymen, soms op irreversibele wijze, hun activiteit.

De effecten van een verandering in temperatuur kunnen worden verklaard op basis van de kinetische theorie: een toename in temperatuur doet de moleculen sneller bewegen waarbij er dus meer botsingen plaatsvinden tussen de moleculen. Dit houdt in dat binnen een bepaalde grens ( vaak 0 - 45 C ) de snelheid van de reactie proportioneel is aan de temperatuur. Bij temperaturen boven normaal  ( zeg 60 C ) zullen enzymen denatureren; dat wil zeggen dat onder invloed van de hoge snelheid de vorm en ruimtelijke opvouwing zullen veranderen waardoor het enzym zijn werking verliest.
Bij steeds lager wordende temperaturen zullen de moleculen steeds minder snel bewegen en dus minder actief worden.

In vele gevallen kan de katalytische werking van de enzymen worden verhoogd door bepaalde stoffen, die activatoren worden genoemd. Voorbeelden hiervan zijn thiolverbindingen (zoals mercapto-ethanol en cysteïne), maar ook tweewaardige metaalionen (Mg2+, Mn2+, Zn 2+ e.d.). Daarnaast zijn er stoffen die de activiteit van de enzymen al of niet reversibel verlagen (inhibitoren of remmers).

Allostere enzymen zijn enzymen waarvan de katalytische activiteit specifiek beïnvloedbaar is door bepaalde metabolieten. Deze laatste binden op een andere plaats dan het om te zetten molecuul van het enzym. Zij veranderen de structuur van het enzym zodanig dat de activiteit óf geremd, óf gestimuleerd wordt; deze invloed op de enzymactiviteit noemt men een allosterisch effect. Zo kunnen stofwisselingprocessen gereguleerd worden. Heel vaak wordt de activiteit van het eerste enzym uit een reactieketen allosterisch geremd door het eindproduct van de reactieketen (negatieve terugkoppeling). Zo stapelt het eindproduct zich niet op (zie ook, Pasteureffect). Met de ontdekking van de allosterische remming van enzymen (1963) zijn de namen van de Franse Nobelprijswinnaars Changeux, Jacques Monod en François Jacob onlosmakelijk verbonden.

Er bestaan ook enzymen die in meer dan één structurele vorm voorkomen in één en hetzelfde (hogere) organisme en toch dezelfde reactie katalyseren, zogeheten iso-enzymen. Een goed onderzocht voorbeeld is dat van melkzuurdehydrogenase, waarvan in totaal vijf verschillende vormen (iso-enzymen) voorkomen. Er zijn kleine enzymatische verschillen tussen de vormen die in de hartspier, de lever en de longen voorkomen; deze vormen beantwoorden echter aan de zeer verschillende fysiologische eisen die aan deze drie organen worden gesteld.
 

Maltose bestaat uit twee aan elkaar gebonden glucose moleculen  (1).
Het enzym Maltase ( Alpha-glucosidase )  is een proteïne die precies zo gevormd is dat het een  maltose molecuul kan accepteren  en de binding kan verbreken.(2).
Twee glucose moleculen blijven over (3).
Een enkel  maltase enzym kan tot 1000 maltose bindingen per seconde verbreken en accepteert alleen maltose moleculen.
Alpha-glucosidase ( EC 3.2.1.20 )
Human genetic disease: Glycogen storage disease II (GSD II) ( Ziekte van Pompe )
OMIM: 232300

In de meeste chemische reacties bestaat een energiebarrière die overwonnen moet worden voordat de reactie plaats kan vinden. Deze barrière voorkomt dat complexe moleculen zoals proteïnen en nucleïnezuren spontaan afgebroken worden en is dus nodig voor het in stand houden van het leven.

Wanneer er echter in de cel bepaalde metabole veranderingen vereist zijn, zullen bepaalde van deze complexe moleculen afgebroken moeten worden en zal de energiebarrière overwonnen moeten worden.

Warmte zou de extra benodigde energie kunnen leveren ( activatie-energie genoemd ), maar de toename in temperatuur zou de cel vernietigen. Het alternatief is de verlaging van de activatie-energie spiegel door het gebruik van een katalysator. Dit is dan ook de rol die enzymen spelen. Zij reageren met het substraat waarbij een overgangscomplex wordt gevormd die minder energie vereist om de reactie te laten verlopen. Het onstabiele tussenproduct zal snel worden afgebroken tot de reactieproducten en het onveranderde enzym is vrij te reageren met andere substraat moleculen.

 Alleen een bepaald gebied van het enzym, de actieve zijde genoemd, zal aan het substraat binden. Deze actieve zijde is een gleuf of holte die gevormd wordt door het driedimensionale vouwpatroon van de proteïne. Deze driedimensionale structuur, tezamen met de chemische en elektrische eigenschappen van de aminozuren in de actieve zijde, staan alleen bepaalde substraten toe te binden aan deze zijde, aldus de specificiteit van het enzym bepalend.  

 De synthese en de activiteit van enzymen kan worden beïnvloed door genetische controle en de verdeling in de cel. Sommige enzymen worden niet geproduceerd door bepaalde cellen en andere worden alleen gevormd wanneer zij nodig zijn. Enzymen worden niet altijd uniform in een cel gevonden; vaak worden zij verdeeld in de nucleus, op het celmembraan of in subcellulaire structuren. De snelheid van de enzym synthese en de activiteit wordt verder beïnvloed door hormonen, neurosecreties en andere chemische stoffen die het interne milieu van de cel beïnvloeden.

 Omdat enzymen niet verbruikt worden in de reacties die zij katalyseren en steeds weer opnieuw gebruikt kunnen worden, is alleen een zeer kleine hoeveelheid van een enzym nodig om een reactie te katalyseren. Een typisch enzymmolecuul kan 1000 substraat moleculen per seconde omzetten. De snelheid van de enzymatische reactie neemt toe met een toenemende substraat concentratie, waarbij de maximale snelheid wordt bereikt wanneer alle actieve zijden van de enzymmoleculen zijn bezet. Het enzym is dan verzadigd waarbij de snelheid van de reactie wordt bepaald door de snelheid waarmee de actieve zijde het substraat in product kan omzetten.

 De activiteit van enzymen kan op verschillende manieren geremd worden. Competitieve remming vindt plaats wanneer moleculen die veel op de substraatmoleculen lijken, zich aan de actieve zijde binden en zo voorkomen dat het eigenlijke substraat zich aan de actieve zijde bindt. Penicilline is een competitieve remmer die de actieve zijde van een enzym blokkeert  die vele bacteriën gebruiken om hun celwand op te bouwen.

 Niet competitieve remming vindt plaats wanneer een remmer zich aan een enzym bindt op een locatie anders dan de actieve zijde. In sommige gevallen van niet-competitieve remming denkt men dat de inhibitor zich op zo’n wijze aan het enzym bindt dat de normale actieve zijde geblokkeerd wordt. In andere gevallen denkt men dat de binding van de inhibitor de driedimensionale vorm van het enzym verandert  en zo de actieve zijde vervormt waardoor er geen reactie met het substraat kan plaatsvinden. De laatste vorm wordt allosterische remming genoemd; de plaats waar de inhibitor aan het enzym bindt, wordt de allosterische zijde genoemd. Vaak zal het eindproduct van een metabole route dienen als een allosterische inhibitor op een eerder enzym in de route. De remming van een enzym door een product van zijn eigen metabole route is een vorm negatieve feedback.

Allosterische controle kan zowel betrekking hebben op de stimulatie van de enzym actie als ook de remming. Een activatormolecuul kan aan de allosterische zijde gebonden worden en een reactie uitlokken aan de actieve zijde door de driedimensionale vorm van de actieve zijde te veranderen waarna er een substraat past die deze vormverandering zelf niet kan uitvoeren. Dit is de basis van de zogenoemde “induced fit” theorie die stelt dat de binding van een substraat of sommige andere moleculen  aan een enzym een verandering in de driedimensionale vorm veroorzaakt waarbij de activiteit verbeterd of geremd wordt. Algemene activators omvatten hormonen en de producten van eerdere enzymatische reacties. Allosterische stimulatie en remming staan de productie van energie en materialen door de cel toe wanneer zij nodig zijn en remmen de productie wanneer de toevoer voldoende is.

Regulatie:
 

Inleiding

regulatie [biochemie],  het geheel van factoren (mechanismen) dat regelend werkt op de hoeveelheid van een enzym in een cel en zijn activiteit. In iedere cel komt een groot aantal verschillende enzymen voor, die de opbouw- en afbraakprocessen van de celstofwisseling verzorgen. Voor het optimaal functioneren van een cel is het van belang dat onder alle omstandigheden slechts díe enzymen werkzaam zijn en in zulke mate, als met dit optimaal functioneren overeenstemt. Een algemeen regelend principe is de terugkoppeling (feedback).

Regulatie van de aanmaak van enzymen

In de erfelijke aanleg van een cel (met name in het DNA) ligt de informatie opgesloten voor de vorming van zeer veel enzymen. Vrijwel nooit wordt deze aanleg in zijn geheel - en zeker niet gelijktijdig - gerealiseerd. De voornaamste mechanismen die in de regulatie van de enzymsynthese een rol spelen, zijn de inductie en de repressie (een voorbeeld van terugkoppeling) van enzymen (dit mechanisme geldt niet voor zogenaamde constitutieve enzymen). Men spreekt in dit geval van een negatieve controle van de gen-activiteit.

Daarnaast zijn er mechanismen waarbij de binding van de RNA-polymerasen aan het genoom wordt beïnvloed en zodoende zowel de specifieke opstarting als de stopzetting van het transcriptieproces wordt geregeld (positieve controle). Vooral bij hogere organismen komen ook mechanismen voor die de translatie van de gevormde boodschapper-RNA regelen.

Regulatie van de enzymactiviteit

Op de beïnvloeding van de feitelijke activiteit van een gegeven hoeveelheid van een bepaald enzym oefenen de volgende factoren invloed uit:

Compartimentalisatie

In de cel komen bepaalde organellen voor (zoals celkern, mitochondriën) die een verschillende uitrusting aan enzymen bezitten. Een enzym in de kern kan uiteraard alleen maar actief zijn als ook zijn substraat daar voorkomt. Voorbeelden van de regulatie door compartimentalisatie zijn het pasteureffect en de werking van lysosomen.

Intrinsieke eigenschappen

Een enzym kan actiever zijn naar gelang zijn eigenschappen zoals zijn pH-optimum of zijn substraataffiniteit. Wat dit laatste betreft: als verschillende enzymen eenzelfde substraat kunnen omzetten (ieder op zijn eigen wijze), dan zal bij een lage concentratie aan substraat alleen het enzym met een grote affiniteit tot dit substraat nog actief kunnen zijn. Pas bij hogere substraatconcentraties zullen ook de andere enzymen met het substraat in interactie kunnen treden.

De aanwezigheid van activerende of remmende substanties

Belangrijk is de eindproductremming: bij de synthese van vele stoffen katalyseert een aantal enzymen een aantal opeenvolgende reacties; vaak is het eindproduct een remstof voor een enzym dat vóór in de keten werkt. Ook dit is een voorbeeld van terugkoppeling. Dit mechanisme, waarbij normale stofwisselingsproducten (metabolieten) als remstoffen of als activatoren optreden, heeft geleid tot het herkennen van de allosterische effecten. Vele enzymen zijn in hun activiteit te reguleren doordat hun conformatie verandert in aanwezigheid van bepaalde metabolieten. Daardoor verandert zowel hun affiniteit voor het substraat als hun activiteit.

Scheiding tussen opbouw en afbraak

Doorgaans vindt in de stofwisseling de afbraak van een stof plaats langs een andere weg dan haar opbouw. De synthese van eiwitten bijv. loopt via een zeer complex systeem waarbij allerlei typen RNA betrokken zijn, terwijl de afbraak hydrolytisch (door kathepsinen) plaatsvindt. Er is dus geen eenvoudig evenwicht tussen aminozuren en eiwit, maar de opbouw en de afbraak kunnen afzonderlijk geregeld worden en naast elkaar, onderling onafhankelijk, verlopen.

Enzymstructuur:

De molecuulmassa en de structuur van enzymen kan zeer variëren.

Ribonuclease, een enzym dat nucleïnezuren hydrolyseert die een ribose-ring bevatten, is bijvoorbeeld een relatief klein eiwit met een molecuulmassa van 13 700 u. Het bestaat uit 1 enkele polypeptideketen van 124 aminozuureenheden.

In tegenstelling hiermee staat de ingewikkelde structuur van het enzym aldolase dat betrokken is bij het glucosemetabolisme.
Dit enzym heeft een molecuulmassa van 156 000 u en bestaat uit vier subeenheden met elk een molecuulmassa van ongeveer 40 000 u.
De polypeptideketens van leveraldolase hebben daarbij ook nog een andere primaire structuur dan de polypeptiden van dit enzym in de spieren.

Het macromoleculaire complex van pyruvaatdehydrogenase is zelfs nog groter. Dit enzym katalyseert de belangrijke omzetting van pyruvaat naar acetylcoënzym A.

Pyruvaatdehydrogenase is een multi-enzymcomplex waarbinnen de verschillende componenten zo sterk aan elkaar verbonden zijn dat het systeem als geheel geïsoleerd kan worden uit verschillende weefsels.

Het complex dat uit varkenshart geïsoleerd wordt, heeft een molecuulmassa van ongeveer 10 000 000 u en bevat 42 verschillende polypeptiden en co-factoren, die allen nodig zijn voor de biologische activiteit.
 

Enzymcofactoren:

Naast het polypeptidegedeelte hebben veel enzymen nog een niet-proteïnecomponent nodig om hun werking te kunnen uitoefenen.

Deze component wordt een cofactor genoemd. Wanneer een cofactor nodig is, wordt het eiwitgedeelte het apoënzym genoemd. De cofactor kan een metaalion zijn dat complex aan het enzym gebonden is. Deze wordt dan de metaalionactivator genoemd.

Enkele voorbeelden van enzymen die een metaal-ion nodig hebben:

Veel enzymen hebben een organisch reagens nodig om de omzetting van substraat naar product tot stand te brengen. Dit kan een verbinding zijn die bijvoorbeeld een hydride-ion, een methylgroep, of een acetylgroep overdraagt naar het substraat. Dergelijke organische verbindingen die in vergelijking met het enzym relatief klein zijn , worden coënzymen genoemd. Er zijn coënzymen voor oxidatie, reductie, alkylering, acylering, isomerisatie, decarboxylering enz.

Oxidatie is het proces waarbij elektronen worden afgestaan.
Reductie is het proces waarbij elektronen worden opgenomen.
Acylering is het proces waarbij aan een molecuul een vetzuur wordt gekoppeld.
Isomerisatie is het ontstaan van stoffen met dezelfde molekuulformule, maar met verschillende structuurformules.
Decarboxylering is het proces waarbij uit een verbinding de carboxylaatgroep verwijderd wordt.
Alkylering is het proces waarbij aan een organische verbinding een alkyl groep wordt toegevoegd.

Een coënzym zelf is niet specifiek voor een bepaald substraat. Het is de combinatie enzym-coënzym die de specificiteit bepaald.

Als een cofactor stevig aan het enzym gebonden zit door middel van covalente of coördinatieverbindingen, dan wordt de cofactor een prosthetische groep genoemd.

Sommige coënzymen zitten stevig gebonden aan het enzym als prosthetische groep, andere komen vrij voor en kunnen door verschillende enzymen gebruikt worden.

De heemgroep is een bekend voorbeeld van een prosthetische groep en is onder meer gebonden aan de cytochromen en aan hemoglobine.
 

Nomenclatuur en indeling van enzymen:

Enzymen worden meestal benoemd naar het proces dat zij katalyseren, gevolgd door de uitgang –ase.

Men kan de enzymen op grond van hun werking indelen in zes hoofdgroepen:

1. Oxidoreductasen

2. Transferasen

3. Hydrolasen

4. Lyasen

5. Isomerasen

6. Ligasen

Oxidoreductasen:

Deze enzymen katalyseren redoxprocessen.

Redoxprocessen zijn processen waarbij door elektronenoverdracht één van de atoomsoorten wordt geoxideerd en een ander gereduceerd.

Oxidatie is het proces waarbij elektronen worden afgestaan en reductie is het proces waarbij elektronen worden opgenomen.

Tot de groep oxidoreductasen behoren de hydrogenasen, oxidasenreductasen, transhydrogenasen en hydroxylasen.

Coënzymen die bij deze groep enzymen veel voorkomen zijn NAD+ en FAD.

• NADH dehydrogenase (ubiquinone)  EC 1.6.5.3  is een voorbeeld uit deze groep.
  
  Dit enzym katalyseert de reactie: NADH +  ubiquinone <=> NAD⁺  +  ubiquinol
  
  Human genetic disease:
  
  Deficiency of Mitochondrial Respiratory Chain Complex I 
  
  ( Mitochondriële Ademhalingsketen Complex I deficiëntie )
  
  Synoniemen: NADH: Q ( I ) Oxidoreductase Deficiency;  Mitochondrial Complex I Deficiency; Deficiency of Mitochondrial NADH Dehydrogenase Component of Complex I; Mitohondrial Myopathy with deficiency of respiratory chain NADH-CoQ Reductase activity.
  
  OMIM: 252010
  
  OMIM: Clinical Synopsis
  
  Extra Informatie: Complex I Homepage

Transferasen:

Deze enzymen katalyseren groepsoverdrachtsreacties zoals methyl-, carboxyl-, acyl-, amino- of  fosfaatgroepsoverdracht.

Tot deze groep behoren onder meer de transfosfatasen ( kinasen ) en de transaminasen.

Een coënzym dat bij de laatst genoemde een rol speelt is pyridoxaalfosfaat.

• Guanidinoacetate N-methyltransferase EC 2.1.1.2 is een voorbeeld uit deze groep.
  
  Dit enzym katalyseert de reactie:
  
  S-adenosyl-L-methionine +  guanidinoacetate <=> S-adenosyl-L-homocysteine +  creatine
  
  Human genetic disease:
  
  Guanidinoacetate methyltransferase deficiency
  
  OMIM: 601240
  
  OMIM: Clinical Synopsis

Hydrolasen:

Deze enzymen katalyseren hydrolysereacties.

Hydrolyse is een splitsing van scheikundige verbindingen onder opneming van water.

Tot deze groep behoren de peptidasen, esterasen, glycosidasen en de fosfatasen.

Een coënzym is niet nodig omdat water het reagens is.

• Cerebroside-sulfatase ( Arylsulfatase A ) EC 3.1.6.8 is een voorbeeld uit deze groep.
  
  Dit enzym katalyseert de reactie: 
  
  Een cerebroside 3-sulfaat +  H₂O <=> een cerebroside +  sulfaat
  
  Human genetic disease:
  
  Metachromatische leukodystrofie  ( Metachromatic leukodystrophy )
  
  Synoniemen voor deze ziekte zijn:MLD; Metachromatische Leukoencephalopathie; Sulfatide Lipidose; Arylsulfatase A DeficiëntieARSA Deficiëntie Cerebroside Sulfatase Deficiëntie.
  
  OMIM: 250100.
  
  OMIM: Clinical Synopsis
  
  OMIM: Metachromatic Leukodystrophy due to deficiency of  cerebroside sulfatase activator.
  
  OMIM: Metachromatic Leukodystrophy , Adult Onset, with normal Arylsulfatase A
  
  e-Medicine: Metachromatic leukodystrophy
  
  Extra informatie: United leukodystrophy Foundation
  
  Extra informatie: Metachromatische leukodystrofie

Lyasen:

Deze enzymen katalyseren de splitsing van koolstof-koolstof ( C-C ), koolstof-zuurstof ( C-O )  en koolstof-stikstof ( C-N ) bindingen door middel van eliminatiereacties.

Tot deze groep behoren de decarboxylasen en de dehydratasen.

Coënzymen die behulpzaam zijn bij deze categorie enzymen zijn onder meer Coënzym A en thiaminepyrofosfaat.

• Fumarate hydratase EC 4.2.1.2 is een voorbeeld uit deze groep.
  
  Dit enzym katalyseert de reactie:  (S)-malate <=>  fumarate +  H₂O
  
  Human genetic diseases:
  
  Fumarase deficiency MIM:606812
  
  Multiple cutaneous and uterine leiomyomata (MCUL1) MIM:150800
  
  Hereditary leiomyomatosis and renal cell cancer (HLRCC) MIM:605839

Isomerasen:

Deze enzymen katalyseren isomerisatiereacties.

Isomeren zijn stoffen met dezelfde molekuulformule, maar met verschillende structuurformules.

Tot deze groep behoren de racemasen en de epimerasen.

• Fosfohexose-isomerase  (Glucose-6-phosphate isomerase) EC 5.3.1.9  dat in de glycolyse de omzetting van glucose-6-fosfaat in fructose-6-fosfaat katalyseert, is een voorbeeld uit deze groep.
  
  Dit enzym katalyseert de reactie: D-glucose 6-phosphate <=> D-fructose 6-phosphate
  
  Human genetic disease:
  
  Glucose-6-phosphate isomerase deficiency
  
  OMIM: Hemolytic anemia due to phosphoglucose isomerase deficiency
   

Ligasen :

deze enzymen katalyseren de koppeling van twee substraten waarbij een binding van een koolstofatoom met een zuurstof-, stikstof-, zwavel- of een ander atoom gevormd wordt.

De energie die voor de bindingsvorming nodig is wordt meestal geleverd  door hydrolyse van ATP.

Tot deze groep behoren de synthetasen en de carboxylasen.

Coënzymen die bij deze categorie enzymen voorkomen zijn coënzym A en biotine.

• Pyruvate carboxylase EC 6.4.1.1 is een voorbeeld uit deze groep.
  
  Dit enzym katalyseert de reactie:
  
  ATP +  pyruvate +  HCO₃^-  <=> ADP +  phosphate +  oxaloacetate
  
  Human genetic disease:
  
  Pyruvate carboxylase deficiency
  
  Synoniemen: PC Deficiency;  Ataxia with lactic acidosis II;  Leigh Syndrome due to Pyruvate Carboxylase Def.; Leigh Necrotizing Encephalopathy due to pyruvate carboxylase deficiency
  
  OMIM: 266150
  
  OMIM: Clinical Synopsis
  
  e-Medicine: Pyruvate Carboxylase Deficiency

Binnen deze hoofdgroepen vindt naar soort substraat of reactietype nog een verdere onderverdeling plaats in subgroepen en sub-subgroepen, waarbinnen de afzonderlijke enzymen genummerd worden.

Elke groep heeft een eigen codecijfer waardoor men de enzymen kan indelen door middel van een vierdelig codenummer. ( het enzym classificatienummer of EC nummer).

Elk volgend cijfer van het nummer geeft dus een meer gedetailleerde onderverdeling en op deze wijze is naast de triviale naam en de systematische naam nog een derde aanduiding voor een enzym mogelijk.

De systematische naam van bijvoorbeeld lactaatdehydrogenase   ( triviale naam ) is L-lactaat-NAD-oxidoreductase en het codenummer is EC 1.1.1.27.

( EC 1.1.1.27 ) 

Restrictie enzymen

Restrictie enzym of ook wel Restrictie endonuclease:

De term restrictie vindt zijn oorsprong in het feit dat deze enzymen werden ontdekt in E. coli strengen die de infectie van zekere bacteriofagen bleken te beperken.

 "Endo" in endonuclease betekent dat  een enzym binnen in een DNA-streng knipt; Grieks: endo = in - binnenin.)

Nuclease: enzymen die de hydrolyse katalyseren van phosphodiester bindingen tussen nucleïne zuren in DNA moleculen.

Een restrictie-enzym of ook wel restrictie endonuclease genoemd,  is een proteïne die geproduceerd wordt door bacteriën. Deze proteïnen zijn in staat  DNA-moleculen op een specifieke manier in kleinere fragmenten te splitsen. Een bijzondere eigenschap van deze enzymen is bovendien dat ze een bepaalde (voor elk enzym kenmerkende) specifieke basenparen-volgorde (ook wel sequentie genoemd) (minimaal 4 basenparen) in het DNA herkennen en alleen op deze specifieke plek in het DNA de fosfodiësterbindingen tussen de nucleotiden hydrolyseren. (het "knippen").

Er bestaan verschillende typen restrictie enzymen en die kunnen allemaal een andere volgorde herkennen. Sommige enzymen knippen beide DNA-strengen door op dezelfde plaats (blunt end); anderen knippen de strengen schuin door, op enkele basen van elkaar verwijderd (sticky end).

Met behulp van andere enzymen, de ligasen, kunnen de verschillende fragmenten weer aan elkaar worden gelijmd. Het enzym EcoRl herkent bijvoorbeeld zes basenparen (GAATTC), terwijl het enzym Sau3AI slechts vier basenparen (GATC) herkent. De eerste wordt daarom een '6-knipper' genoemd, terwijl de tweede een '4-knipper' wordt genoemd

Een bacterie gebruikt restrictie-enzymen als een afweermechanisme tegen soortvreemd DNA, zoals bijv. het DNA van een bacteriofaag (een type virus dat specifiek bacteriën aantast ) die de cel infecteert. Wanneer een faag een bacterie infecteert, zal de faag zijn DNA in de bacteriële cel plaatsen zodat dit DNA zich kan vermeerderen. Een restrictie endonuclease voorkomt de vermeerdering van het DNA van de faag door het DNA van de faag in vele stukken te knippen. Het eigen DNA van de cel wordt tegen afbraak beschermd door enzymatische modificatie (methylering) van de specifieke herkenningsplaatsen van het restrictie-enzym. Een klein gedeelte van het bacteriofaag DNA ontsnapt eveneens aan restrictie doordat het ook specifiek gemethyleerd wordt. Een faag dat een dergelijk gemodificeerd DNA bevat, vermenigvuldigt zich, bij een tweede infectie van dezelfde gastheer, veel beter dan het oorspronkelijke faag met ongemodificeerd DNA.

Er zijn veel bacteriestam specifieke restrictie-enzymen. Alleen bacteriofagen, die uit dezelfde bacteriestammen komen hebben de mogelijkheid de methylering te omzeilen en kunnen zich zo in de bacterie vermeerderen. De vermeerdering is dus beperkt tot deze stammen, vandaar de naam restrictie-enzym.

Voor hun grondleggend onderzoek naar restrictie-enzymen en hun toepassing in de moleculaire biologie kregen Werner Arber,  Daniel Nathans en Hamilton Othanel Smith in 1978 de Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde.

Overzicht restrictie endonucleasen: New England BioLabs.

Typen:

Er zijn drie typen restrictie-enzymen, type I, II en III genoemd.  

Type I enzymen zijn complexe, multisubunit, combinatie restrictie- en –modificerings enzymen  die het DNA op een willekeurige plaats ver van de herkenningsplaats knippen.

Type II knipt het DNA op bepaalde plaatsen dicht bij of binnen de herkenningsplaats.

Type III enzymen zijn net als type I enzymen grote enzymcomplexen die het DNA ongeveer 20 tot 25 baseparen van de herkenningsplaats verwijderd knippen.

Type I en III enzymen zijn gelijk in de zin dat zowel de restrictie als de methylase activiteit worden uitgevoerd door een groot enzymcomplex, dit in tegenstelling tot type II waarbij de restrictie enzym onafhankelijk is van de methylase activiteit.

In het dagelijks leven wordt meestal met restrictie-enzym type II bedoeld, omdat de andere twee typen van minder belang zijn in de moleculaire biologie. De naam van een restrictie-enzym geeft de herkomst aan. Het enzym EcoRI bijvoorbeeld is het eerst gevonden enzym uit de stam Escherichia coli R en AluI is het eerste enzym uit Arthrobacter luteus. Restrictie-enzym, die opdezelfde plaatsen knippen maar afkomstig zijn uit verschillende organismen worden isoschizomeren genoemd; knippen ze in dezelfde sequentie, maar zijn de knipeinden verschillend dan worden ze neoschizomeren genoemd.

Toepassingen:

Nathans was de eerste die besefte dat type II-restrictie-enzymen een zeer belangrijk gereedschap kon zijn bij het onderzoek naar de organisatie van genen op het DNA.
Met deze enzymen, waarvan er inmiddels meer dan 3000 zijn geïsoleerd, met elk hun eigen herkenningsvolgorde, is het mogelijk lange DNA-moleculen reproduceerbaar in precies gedefinieerde fragmenten (restrictiefragmenten) te knippen.

Men kan een restrictie-analyse uitvoeren door de fragmenten op lengte te scheiden met behulp van elektroforese in agarose of polyacrylamide.
De resultaten worden verwerkt tot een restrictiekaart waarop de onderlinge ligging en afstand van de knipplaatsen van de verschillende restrictie-enzymen (restrictie-plaatsen) zijn aangegeven.
Een dergelijke restrictiekaart kan ook worden opgesteld voor de restrictiefragmenten van één individueel gen. Dit is een belangrijk hulpmiddel bij het ophelderen van de fijnstructuur (nucleotidenvolgorde) van het gen.
Daartoe worden de verschillende fragmenten van het gen, met behulp van de recombinant DNA-techniek, afzonderlijk gekloneerd en wordt hun nucleotidenvolgorde bepaald.

Het functioneren van het gen kan worden bestudeerd door specifieke fragmenten te verwijderen, te vervangen door andere of te muteren. Type II-restrictie-enzymen vormt dan ook een van de pijlers waarop het hedendaagse DNA-onderzoek rust. Tussen individuen van dezelfde soort bestaan soms kleine verschillen in de restrictiekaart van een bepaald stuk DNA als gevolg van één of meer mutaties die restrictieplaatsen hebben vernietigd of nieuwe plaatsen hebben gecreëerd. Dit restrictiefragment lengte polyformisme (RFLP) kan onder meer worden gebruikt als hulpmiddel bij het geven van een genetisch advies.
Is eenmaal vastgesteld dat in een familie een bepaald restrictiepatroon gecorreleerd is met de aanwezigheid van een (recessieve) mutatie die een erfelijke afwijking veroorzaakt, dan kan middels restrictie-analyse worden bepaald of de betreffende ouder mogelijk drager van deze mutatie is; ook prenatale diagnose is langs deze weg mogelijk.

Indeling type II restrictie endonucleasen:

Het hoofdcriterium voor de indeling als een type II restrictie enzym is:

• De enzymen knippen het DNA op bepaalde plaatsen dicht bij of binnen de herkenningsplaats.
   

• De activiteit van het enzym vereist geen ATP hydrolyse

Omdat vele type II enzymen niet aan deze beperkte definitie voldoen is het nodig een aantal subindelingen te definieren:

Table 1. Subtypes of Type II REases

Subtypea Defining feature Examples Recognition sequence A Asymmetric recognition sequence FokI GGATG (9/13)     AciI CCGC (–3/–1) B Cleaves both sides of target on both strands BcgI (10/12) CGANNNNNNTGC (12/10) C Symmetric or asymmetric target. R and M functions in one polypeptide GsuI CTGGAG (16/14)     HaeIV (7/13) GAYNNNNNRTC (14/9)     BcgI (10/12) CGANNNNNNTGC (12/10) E Two targets; one cleaved, one an effector EcoRII CCWGG     NaeI GCCGGC F Two targets, both cleaved coordinately SfiI GGCCNNNNNGGCC     SgrAI CRCCGGYG G Symmetric or asymmetric target. Affected by AdoMet BsgI GTGCAG (16/14)     Eco57I CTGAAG (16/14) H Symmetric or asymmetric target. Similar to Type I gene structure BcgI (10/12) CGANNNNNNTGC (12/10)     AhdI GACNNNNNGTC M Subtype IIP or IIA. Require methylated target DpnI Gm6 ATC P Symmetric target and cleavage sites EcoRI GAATTC     PpuMI RGGWCCY     BslI CCNNNNNNNGG S Asymmetric target and cleavage sites FokI GGATG (9/13)     MmeI TCCRAC (20/18) T Symmetric or asymmetric target. R genes are heterodimers Bpu10I CCTNAGC (–5/–2)b     BslI CCNNNNNNNGG

^aNote that not all subtypes are mutually exclusive. E.g. BslI is of subtype P and T.

^bThe abbreviation indicates double strand cleavage as shown below:

5' C CT N A G C

3' G G A N TC G

Voorbeelden van restrictie enzymen

Note: Only one strand of the target DNA is shown, in the interests of clarity. It will be noted that the omitted strand has the same sequence as the one show, but the nucleotides occur in the reverse order. Thus for example The complementary sequence for Sal I (with its point of cleavage indicated as above) is 5' -C A G C T * G-3'. These are hence said to be palindromic sequences, and double-stranded cuts produce short sinlge-stranded cohesive ends.

LINK: Structure and Function of Type II Restriction Endonucleases (PDF)

Denatureren van eiwitten

Bij het denatureren van eiwitten worden de secundaire, tertiaire en quaternaire structuur verbroken omdat de balans tussen alle aantrekkende en afstotende krachten in een eiwitketen verstoord wordt. Hierdoor verandert de driedimensionale vorm van het eiwit. Sommige eiwitten zijn uit de aard van hun functie vrij goed bestand tegen denaturering: bijvoorbeeld huid, haar en nagels worden niet gemakkelijk gedenatureerd omdat ze veel disulfidebruggen bevatten.
Veel enzymen daarentegen worden snel gedenatureerd wanneer hun omgeving teveel gaat afwijken van de natuurlijke omstandigheden. Door denaturering gaat de activiteit van het enzym verloren.
Denaturering kan op verschillende manieren gebeuren, bijvoorbeeld door temperatuurverhoging of pH-verandering. Meestal coaguleren (stollen) eiwitten bij het denatureren ( stremmen, uitvlokken). Een bekend voorbeeld voorbeeld van denatureren door temperatuurverhoging is het geleren van het eiwit (albumine) van een ei tijdens het koken, het inactiveren van enzymen en het doden van bacteriën door verhitten.
Ionen van zware metalen kunnen een eiwit denatureren omdat ze binden aan thiol-groepen waardoor het eiwit neerslaat. Ook kunnen ze complexen vormen met de carbonylgroepen in een eiwit  waardoor waterstofbruggen in het eiwit verbroken worden. Ook bestraling, ultrasone vibratie, oxidatie, reductie (verbreken S - S bruggen) en het toevoegen van detergentia of organische oplosmiddelen kan denaturering veroorzaken. De desinfecterende werking van  een 70% ethanoloplossing berust op de snelle denaturering van bacterie-eiwitten, waardoor de bacteriën gedood worden.

Klinische enzymologie